> <
  • 1

Colaboraciones

  • All
  • Artículos
  • Boletin 99
  • Boletin 100
  • Ultimo

Cuantificación de la viabilidad celular mediante azul de tripano en la criopreservación de células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica.

Quiles FJ 1, Giménez A 1, López J 1, Poveda E 1, Rodríguez A 1, Mirabet V 2, Vayá MJ 2, Hernández MC 3, García GM 3, Mata JJ 4, Aranburu E 5, Antelo ML 6, Rodríguez L 7.

1 Centro de Transfusión, Banco de Células y Tejidos y Banco de Leche de la Comunidad Valenciana; Alicante.
2 Centro de Transfusión, Banco de Células y Tejidos y Banco de Leche de la Comunidad Valenciana; Valencia.
3 Centro de Transfusión, Tejidos y Células de Málaga.
4 Hospital Quirón de Torrevieja.
5 Banco de Sangre y Tejidos de Navarra.
6 Servicio de Hematología del Complejo Hospitalario de Navarra.
7 Banc de Sang i Teixits. Barcelona.

REVISIÓN
Palabras clave: células madre hematopoyéticas, criopreservación, viabilidad celular, azul de tripano.

 

RESUMEN

Aunque la citometría de flujo es el método de referencia a la hora de cuantificar la viabilidad celular de los progenitores hematopoyéticos no es una técnica al alcance de todo el mundo ni en cualquier momento y también presenta su problemática.
Los estándares FACT-JACIE de 2018 siguen admitiendo, bajo ciertas premisas, el uso de la tinción por exclusión del azul de tripán para cuantificar dicha viabilidad. Se trata de una técnica sencilla, rápida (unos 10 minutos) y barata que cualquiera puede poner en marcha.
El primer objetivo de esta revisión es estandarizar dicha técnica para su uso en el trasplante de progenitores hematopoyéticos en los establecimientos de tejidos dado que existe en la literatura disparidad en la metodología y en los resultados. Hacemos una evaluación preliminar de la misma en la fase de precongelación, tras la descongelación simple sin manipulaciones adicionales (en una alícuota del producto, vial o tubo piloto, aunque podría ser en la descongelación con infusión directa) y tras descongelación con lavado previo a la infusión al enfermo. En la primera y tercera fases la impresión es satisfactoria mientras que en la segunda, aunque se encuentra en línea con lo publicado, creemos que el método es mejorable y sugerimos el camino.
Y el segundo objetivo plantear en qué etapas del procesamiento realizar dicha técnica de un modo rutinario. También es útil en procesos de validación.
A posteriori, junto con otros grupos de trabajo interesados y de una forma muy sencilla, procederá establecer los resultados definitivos esperables con su uso.

 

INTRODUCCIÓN

A raíz de la reciente publicación de los nuevos “estándares internacionales FACT-JACIE sobre terapia celular hematopoyética, recolección, procesamiento y administración” 1 y su manual asociado que han entrado en vigor el pasado 1 de junio, un grupo de compañeros hemos puesto en común una serie de cuestiones algunas de ellas recurrentes.Estos estándares establecen unos mínimos generales pero aunque solo sea por el hecho de ser internacionales tienen que dar cabida a las peculiaridades de los distintos centros que además pertenecen a muy diferentes países.De las sucesivas fases que cabe considerar en relación al proceso del trasplante en el presente artículo nos centraremos en analizar las que competen a los establecimientos o bancos de tejidos, es decir, recepción, procesamiento, almacenamiento y distribución de las células progenitoras hematopoyéticas (CPH). Fases sobre las que, por otra parte, cuando algo va mal, se dirigen algunas miradas ya que es un punto crítico muy propicio para la discusión. Ahora bien, no parece razonable intentar conseguir un grado de certidumbre absoluta haciendo prácticamente de todo en cada una de las diferentes etapas, con los mejores medios y a cualquier coste.
En la manipulación de las CPH, sean de sangre periférica o aféresis (CPH-A) o de otro origen, hay unos controles de calidad entre los que figuran los siguientes, aunque hay quienes sugieren realizar otros 2: cuantificación de células nucleadas totales (CNT), cuantificación de células CD34+, viabilidad de las mismas, potencial clonogénico de las células madre o cultivos microbiológicos para bacterias y hongos.
Llegados a esta tesitura en el Centro de Transfusión de la Comunidad Valenciana mantuvimos una reunión de la que surgieron algunas preguntas que luego compartieron compañeros de otros centros y terminamos convirtiendo este trabajo en multicéntrico:

  • Una de ellas era: ¿en qué fases del procesamiento realizamos los controles? Aquí podemos distinguir, en función de la situación de las células, las siguientes:
    • Precongelación: con las células en fresco tras la aféresis en su propio medio sin aditivos de ningún tipo.
    • Posdescongelación sin manipulaciones adicionales: simple descongelación, sin grandes manipulaciones adicionales, solo las imprescindibles. Puede tratarse de una alícuota del producto, un tubo piloto, para efectuar controles o del producto de descongelación para infusión directa al enfermo sin lavado previo.
    • Posdescongelación con lavado preinfusión: Además de descongelarlas se les somete a un proceso de lavado para eliminar la mayor cantidad posible de dimetilsulfóxido (DMSO) y detritus e infundirlas a continuación.
  • ¿Qué controles nos gustaría realizar en cada una de las fases?
  • ¿Sería eso posible y práctico?

 

Los estándares antes mencionados siguen admitiendo la utilización de la técnica de tinción por exclusión del azul de tripano para la cuantificación de la viabilidad de las CNT 3,4. Esta circunstancia puede solventar algunos de nuestros problemas pero para ello habría que detallar cómo aplicarla para nuestros fines, qué resultados admitir como razonables y en qué fases ponerla en práctica. Y a estas tres preguntas trataremos de dar respuesta. Se decidió que fuese el Centro de la Comunidad Valenciana en Alicante el encargado de ponerla en marcha con la colaboración y asesoramiento del resto de compañeros, cada vez más numerosos, tras ir sintiéndose interesados por el tema.

Pero, ¿es una técnica desfasada?: en absoluto, si bien lo que mide es la viabilidad conjunta de las CNT y no la específica de las CD34+. Tan es así que a pesar de la antigüedad del procedimiento sigue siendo el más utilizado a nivel mundial para cuantificar la viabilidad 5,6. Hablamos no solo en relación al campo de la Hematología y Hemoterapia, ni tan siquiera del de la medicina en su conjunto, se usa en otras muchas facetas de la biología y a nivel industrial. Ahora era cuestión de adaptarla a nuestras necesidades y hacerla reproducible. Porque es una prueba muy útil, sencilla, rápida y barata que cualquiera puede poner en marcha 4.

Sin olvidar que para determinar la viabilidad tenemos como método de referencia la citometría de flujo (CMF) habitualmente siguiendo el protocolo ISHAGE y empleando 7-aminoactinomicina D (7-AAD) 7.

Ahora bien, asumiendo lo antedicho, en las conversaciones entre compañeros y también revisando la literatura surge cierta controversia:

  • No todo el mundo tiene a mano, al menos en un tiempo prudencial, la citometría.
  • Ya no depende solo del personal de Criopreservación.
  • Con las células en fresco y con tiempo, horas para poder realizarla, no hay demasiado problema para cuantificar las CD34+ y su viabilidad. Una vez congeladas la cosa se complica sustancialmente 8.
  • Es bastante más laboriosa.
  • Mucho más cara. Requiere instalaciones, aparatos y cualificación técnica especializada.
  • Si la unidad es ajena al establecimiento de tejidos debe estar acreditada o certificada 1.
  • Está descrito que no siempre, ni siquiera grupos de trabajo que sigan el protocolo ISHAGE, obtienen los mismos resultados 7.
  • Todo lo cual no es óbice para que numerosos grupos obtengan excelentes resultados. Existe un problema pero, obviamente, cada cual es esclavo de sus circunstancias.

Existen además otras técnicas, manuales o automáticas, algunas con buenos resultados y otras no tanto 5,11. Pero en general son más complejas y caras y sobre todo las automáticas están diseñadas para volúmenes de muestras muy superiores a los que se manejan en el trasplante de CPH. Nosotros, en Alicante, concretamente las de sangre periférica para trasplante autólogo (llevamos hechas más de 2.500 aféresis), pues el resto de procedimientos están centralizados en la matriz, Valencia, inclusive el Banco de Cordón.

Por todo ello nos propusimos revisar el estado de la cuestión y tratar de buscar soluciones. En consecuencia este artículo es básicamente una revisión solo que para facilitar la descripción hemos creído oportuno utilizar este formato de presentación. También detallamos el procedimiento para que pueda ser plasmado en uno de laboratorio sin dificultad, por si otros equipos de trabajo sienten interés y se suman a este proyecto.

De entrada es posible que en un mundo automatizado el tener que coger el microscopio o pensar en la cámara de Neubauer genere cierto rechazo. Ahora bien, estamos en condiciones de decir que una vez instaurada la técnica es muy sencilla, se puede llevar a cabo en unos 10 minutos y resuelve muchos problemas 4.

MATERIALES Y REACTIVOS

- Tabletas de PBS (salino tamponado de fosfatos, Merck-Sigma-Aldrich, referencia P4417-100TAB). Precio por tableta: 1,41 €.
- Botella para disolver las tabletas.
- Tubos para alicuotarlas.
- Azul tripán al 0,4% (p/v), solución en PBS, estéril y filtrado (Trypan blue solution, Merck-Sigma-Aldrich, referencia T8154-100 mL). Precio del frasco: 35.50 €.
- Vea fichas de seguridad de los reactivos.
- Tubos de hemólisis.
- Micropipeta automática de 10-100 µL.
- Puntas para pipeta.
- Pipetas Pasteur.
- Cámara de Neubauer mejorada de doble cámara.
- Cubreobjetos corrientes para la cámara de 20x26 mm o en su defecto de 22x22 mm.
- Cronómetro.
- Microscopio óptico convencional. Oculares 10x. Objetivos 10x, 20x y 40x.
- Contador de células de al menos 2 posiciones.
- Y a posteriori incluimos: albúmina humana al 20%, Grifols®, España.

 

MÉTODO

La tinción con azul tripán, azul tripano o trypan blue nos permite distinguir las células no viables de las viables expresando en función del porcentaje de estas últimas  su viabilidad. Su fundamento consiste en que las células vivas, con membrana citoplasmática íntegra, excluyen el colorante y no se tiñen; en cambio penetra en las muertas con lesión de la membrana celular lo que hace que se vean de color azul 3.

La hemos adaptado para CPH-A que se encuentren en suspensión. Como decíamos también es aplicable a otras células y tejidos realizando las oportunas modificaciones.

La lectura puede ser más o menos sofisticada dependiendo básicamente de su finalidad y de la experiencia de quien la ejecuta. Para formación del personal sería razonable trabajar con células en fresco, cámara de Neubauer y contaje de 400 células. Para un experto, tal y como ocurre al examinar una extensión de sangre periférica o médula ósea, de lo más trascendente es el vistazo panorámico inicial. En un producto descongelado hay que acortar los tiempos.

PREPARACIÓN DEL PBS, AZUL TRIPÁN Y SUSPENSIÓN CELULAR

PBS:

  1. Disuelva en una botella 1 tableta en 200 mL de agua desionizada.
  2. De cuando en cuando mezcle.
  3. Una vez disuelta, trascurridos unos 10 minutos, alicuote en 10 tubos de 20 mL. Rotúlelos con el nombre del producto y la fecha de caducidad.
  4. Consérvelos a 4ºC.

Observaciones:

  • Del modo descrito le damos una caducidad de 30 días aunque podría ser mayor.
  • No obstante puede utilizarse desde a temperatura ambiente para un consumo temprano hasta esterilizar las alícuotas y conservarlas durante largo tiempo, por ej. para cultivos celulares.
  • Una vez disuelto tiene un pH de 7,4 y tanto osmolaridad como concentraciones iónicas son semejantes a las del cuerpo humano.

 

Azul tripán:

  • Presentación: listo para su uso.
  • Emplee la solución reseñada, no el producto en polvo.
  • Protéjalo de la luz.
  • Fíltrelo con filtro de 0,2 micras si lleva tiempo almacenado.
  • Las determinaciones se deben hacer en una solución libre de plasma dado que las proteínas plasmáticas se tiñen con el colorante. Lo mismo ocurre con los detritus celulares.

 

Suspensión celular (método general):

  1. Mézclela bien.
  2. Diluya las CPH en un tubo con PBS para obtener una concentración final de CNT de en torno a 5x109/L para que el conteo resulte cómodo sin prestarse a errores.
  3. Homogeneice de nuevo.
  4. Mezcle 50 µL de suspensión celular con 50 µL de azul tripán; es conveniente hacerlo en esta cantidad y no en una menor para homogeneizar correctamente. No obstante, si dispone de producto en exceso utilice 100 µL + 100 µL. El mínimo serían 30 µL de células con 30 µL de azul tripán.
  5. Incube durante 3 minutos a 4ºC. Mezcle de cuando en cuando.

Observaciones:

  • Incluya en el tiempo de incubación el necesario para diversos menesteres: carga de la cámara, asentamiento de las células, etc.
  • Recuerde que las células deben encontrarse como elementos individuales.
  • Tenga todo preparado antes de descongelar el producto, si es el caso, y de efectuar la mezcla. Esto incluye tener montado el cubre sobre la cámara, en posición y enfocado el microscopio para ver la retícula, etc.
  • Evite la formación de burbujas en cualquiera de los pasos.
  • Con el uso de la técnica el proceso se va simplificando sustancialmente.
  • Puede aplicarla al producto en las circunstancias que considere oportunas pero habrá que tener en cuenta algunas consideraciones particulares. Nosotros la usamos en las fases anteriormente descritas con las células en su estado correspondiente:
    • Precongelación.
    • Posdescongelación sin manipulaciones adicionales. Tenemos que actuar sin pérdida alguna de tiempo. Descongele las CPH en baño termostático a 37ºC y proceda como se ha indicado pero reduzca la incubación al tiempo imprescindible para efectuar la lectura. Vea antes la discusión de este artículo.
    • Posdescongelación con lavado preinfusión con soluciones hipertónicas listo para infundir al paciente 12. Este proceso lo realizamos en la Comunidad Valenciana con el Cobe® 2991 Cell Processor (Terumo BCT®) 13,14.

De forma somera indicaremos que está basado en el reconocido método de Rubinstein también nombrado como el del New York Blood Centre 13, 15, 16. En el primer lavado se utiliza una solución de dextrano 40 (p.m. 40.000) al 10% en salino fisiológico (Plander 40000®, Fresenius Kabi, Italia) al que se añade albúmina humana al 20% (Grifols®, España) y ACD-A (Grifols®, España). En sucesivos lavados y para resuspender el producto de cara a su  infusión la solución tiene una composición similar pero sin dextrano para reducir su osmolaridad.

CÁMARA DE NEUBAUER: DESCRIPCIÓN.

Es un hemocitómetro diseñado en principio, como su nombre indica, para el recuento de las células sanguíneas, pero utilizado después para el de las contenidas en multitud de muestras biológicas. Está adaptada al microscopio óptico convencional o de campo claro. Como las dimensiones de sus distintas partes están perfectamente definidas, efectuando los cálculos oportunos llegan a obtenerse resultados bastante precisos, por ej. de leucocitos, hematíes y plaquetas en sangre periférica. Pero para la técnica que nos interesa basta con contar células distinguiendo únicamente las viables de las no viables.

Se trata de una base rectangular y gruesa de vidrio óptico con forma de portaobjetos. En el tercio medio se hallan cuatro ranuras que transcurren en paralelo con respecto a los laterales cortos. Las dos superficies laterales más grandes sirven para rotulación. Tiene dos puentes exteriores para soporte del cubreobjetos. En la parte central existe otro puente partido en dos, de menor altura que los exteriores, en el cual se encuentra grabada la cuadrícula. En el caso de cámaras dobles, que son las más comunes, existen 2 zonas de conteo en el puente central, una anterior y otra posterior.
Cuando se coloca un cubreobjetos sobre los puentes exteriores, entre el mismo y el puente central queda una ranura capilar de 0.1 mm destinada a rellenarse con la suspensión celular.

Retícula de recuento:
Es una cuadrícula solo visible con detalle al microscopio. Muestra 9 cuadrados grandes cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadrados grandes de las esquinas están divididos en otros 16 cuadrados y se utilizan para el recuento de leucocitos; en ellos será también donde hagamos el recuento para obtener la viabilidad.

 
Retícula

 CÁMARA DE NEUBAUER: LLENADO.

1. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara de conteo. Para ello humedezca con agua los puentes y luego sitúe suavemente el cubreobjetos desde delante.
2. Homogeneice adecuadamente y cargue 15 μL de la suspensión celular con azul tripán en la pipeta.
3. Para el llenado de la cámara deposite unos 10 μL en la ranura que se distribuirán por capilaridad. Si la carga no es completa o se ven burbujas de aire hay que repetir el proceso.
4. Deje trascurrir 1 minuto aproximadamente para que asienten las células. 11
5. Cuente de inmediato. La demora puede conducir al fracaso de la prueba.
Observaciones:
- Cargue y lea primero la cámara delantera.

 CÁMARA DE NEUBAUER: RECUENTO CELULAR, GENERALIDADES.

Como decíamos se puede usar en ensayos que proporcionan un recuento celular total o de solo células viables y no viables.
Para que las células no se cuenten dos veces o se pasen por alto, por ej. las que están encima o cerca de las líneas de limitación, hay que atenerse a determinadas reglas:
- De las tres líneas que se observan en los cuadrados periféricos la central es la que delimita su superficie.
- Se deben contar todas las células dentro de una zona de medición definida.
- Se cuentan las células marcadas en negro en el dibujo de abajo. De las que tocan en los lados, por convención, solo las que lo hacen en el superior o en el izquierdo.

 

 - El contaje debe realizarse en forma de meandro, como se indica en la siguiente figura, empezando por los cuadrados superiores e izquierdos.

 

 

 

Observaciones:
- El diafragma del condensador del microscopio deberá estar semicerrado.
- El contaje celular no hay que realizarlo con la cámara reseca.

 

CÁMARA DE NEUBAUER: RECUENTO CELULAR, RESULTADOS.

Introducción 11:
- Las células no viables con rotura de la membrana citoplasmática se tiñen de azul. Además suelen verse hinchadas, más grandes y con peor delimitación.
- Las viables se observan como células netamente delimitadas, claras, traslúcidas, refringentes. Ocasionalmente pueden verse con colorante a su alrededor o con algún grumo en el exterior pero no penetrando en el citoplasma de forma difusa.
Método académico:

  1. Empiece por el cuadrado grande del vértice superior izquierdo.
  2. Cuente 100 células nucleadas distinguiendo las viables de las no viables.
  3. Haga lo propio con el cuadrado grande del vértice superior derecho. Pase luego al inferior derecho y lea por último el inferior izquierdo.
  4. Sumadas las células viables de los 4 cuadrados divida entre 4.En algunos centros con experiencia, y para que no trascurra demasiado tiempo para las células, se hace solo el recuento de 2 cuadrados grandes en diagonal, el superior izquierdo y el inferior derecho, para luego hacer la media. La diferencia entre el recuento de ambos cuadrados no podrá superar el 10%.
  5. Exprese la viabilidad como el porcentaje de células viables respecto al total de contabilizadas.
    Observaciones:
    - Se suele emplear el objetivo 10x de inicio para enfocar bien las líneas de la retícula. Luego ya se pasa al 20x y al 40x. Ajuste el diafragma.
    - Evite confundir las células más pequeñas con plaquetas o detritus grandes.
    - Para aceptar una viabilidad del 100% es preciso observar células muertas aunque sea aisladamente.
    - Cuando se incorpora un trabajador nuevo hay que validar sus lecturas.
    - Especialmente al trabajar con CPH descongeladas sin tratamientos adicionales no se puede perder tiempo.


RECUENTO CELULAR UTILIZANDO PORTAOBJETOS CLÁSICO

Nos referimos al de vidrio trasparente o esmerilado en un extremo de 75mm x 25mm o similar y su correspondiente cubreobjetos.
Acorta al máximo los tiempos. Para usar en determinadas circunstancias como la realización de experimentos, en manos muy expertas o cuando no se disponga de cámara de Neubauer.
Proceda como con la técnica antes descrita pero:

  1. Mezcle las células con azul de tripán volumen a volumen tal y como se ha indicado e incube. Tenga presente que la concentración celular será muy alta.
  2. Con una pipeta Pasteur coloque en el portaobjetos 1 gota (20 µL) de la mezcla.
  3. Haga la extensión y póngale un cubreobjetos.
  4. Ajuste el diafragma.
  5. Comience la lectura con el objetivo de 20x o 40x para ver el conjunto. La presencia de burbujas invalida la lectura.
  6. Ponga aceite de inmersión.
  7. Con el objetivo 100x cuente 100 células en una zona y otras 100 en otra y haga la media.
  8. Haga también el recorrido en forma de meandro.
  9. Limpie el microscopio con paño suave que no deje restos de fibras y alcohol de 70º.

 

LIMPIEZA

Después del conteo quite el cubre y limpie la cámara con agua o una solución no abrasiva. Séquela con un paño suave que no deje fibras. Puede precisarse limpiarla con alcohol de 70º.

SEGURIDAD

Vea la ficha de seguridad. A continuación se detallan algunos de sus aspectos:
Azul de tripán para microscopía. Ampliamente utilizado y admitido para su uso en los protocolos de 2018.
Etiqueta de peligro. Carcinógeno. Según el puesto de trabajo en función de la concentración y cantidad de la sustancia peligrosa.
Adquiera el producto ya diluido. No prepare la dilución a partir del polvo. Protección respiratoria necesaria en presencia de polvo.
Inflamable. En caso de incendio posible formación de gases de combustión o vapores peligrosos.
Condiciones de almacenamiento: protegido de la luz, bien cerrado. En seco. Mantenga el recipiente en un lugar ventilado.
Evite el contacto con la sustancia. Utilice guantes, prendas, gafas o máscara de protección.
No la vierta en desagües.
Si se produce un derramamiento recoja con precaución para proceder a su eliminación. Aclare.
Producto no peligroso según los criterios de la reglamentación del transporte.
Principales síntomas y efectos, agudos y retardados: efectos irritantes, tos, insuficiencia respiratoria.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

REVISIÓN DE LA LITERATURA

Era nuestra primera necesidad. Abajo reseñamos las cifras de viabilidad por azul tripán en distintas fases de algunos autores, con ciertas variaciones técnicas de unos a otros 6,8,9,10,17. Antes de pasar a la relación ofreceremos una cifra media aproximada del conjunto, si bien se suelen encontrar muestras que se alejan considerablemente de la media y así lo señalan también los indicadores de dispersión:

  • Precongelación. Valores medios aproximados: 95% (85-99%).
    • Vosganian: 95% (rango 88-99%).
    • Rodríguez: 85-99%.
  • Posdescongelación sin manipulaciones adicionales. Valores medios aproximados: 77% (60-95%). El apartado polémico, también para otras técnicas.
    • Vosganian: 85% (62-95%).
    • Lecchi: 85% (32-100%, con 909 viales descongelados).
    • Kubiak: 83% (64-96%).
    • Rodríguez: 75% (60-97%).
    • Winter: 60% (40-80%).
  • Posdescongelación con lavado preinfusión. Media aproximada: 87%.
    • Lecchi: 85%.
    • Rodríguez: 89% (83-95%).

 

NUESTRA EXPERIENCIA

La técnica tal y como la hemos descrito, con nuestras adaptaciones, funciona correctamente para el producto precongelado y para el descongelado y lavado con una solución de estabilización osmótica.
En cualquier caso, en general, nuestros resultados van a ser más consistentes que los ofrecidos en algunas series mediante esta u otras técnicas.
- En la precongelación su utilidad es, básicamente, para comprobar el buen funcionamiento de la tinción y aprendizaje del personal dada su estabilidad, pues aquí es preciso emplear la CMF para disponer, al menos, de la cifra de células CD34+ y su viabilidad 1,8. Nuestros resultados rondan el 96% (90-100%), en línea con la literatura. En consonancia con lo anterior no entra en nuestros planes utilizar el azul tripán en esta fase salvo para validación y para algún caso aislado como el que tuvimos recientemente, fuera del presente estudio, con una viabilidad del 77% confirmada por el tripán.
- Tras descongelación con lavado preinfusión sí encontramos una utilidad clara, para saber lo que estamos infundiendo y para validar el procedimiento que se emplee. Nuestros resultados se sitúan en torno al 85% (80-90%).
- Pero a diferencia de estas dos fases en las que la técnica se muestra robusta y reproducible, menos sensible a pequeñas variaciones especialmente de tiempo, en las muestras descongeladas sin manipulaciones adicionales, con la metodología que hemos empleado, las lecturas eran bastante menos consistentes - nuestros resultados rondan el 72% (60-85%) - luego empezamos a plantearnos nuevas cuestiones y a tomar medidas en consecuencia. Además del día a día también fuimos descongelando algunos tubos de las mismas aféresis en días diferentes. Otra variable para tener en cuenta era que íbamos realizando probaturas simultáneamente. O que nos encontrábamos en una etapa de aprendizaje.
Pero algo llamaba poderosamente la atención: la recuperación de CNT medida con contadores automáticos (hasta 3 modelos distintos de 2 marcas) era muy alta y estable en el tiempo, luego las células seguían existiendo. Por contra, al leer el azul de tripano la viabilidad se alejaba de la obtenida con las muestras en fresco y en ocasiones veíamos morir a las células delante de nuestros propios ojos. Eso nos hizo acortar los tiempos todo lo posible incluso anulando el periodo de incubación tal y como hemos descrito. Pudimos haberlo dejado ahí pero lo creímos insuficiente.
A pesar de que muchos laboratorios, al igual que nosotros, utilizan la dilución directa de las CPH en PBS (medio tamponado pero isotónico), salino fisiológico o similar, nos parecía el principal motivo de sospecha de que a nosotros la prueba no nos saliese como deseábamos. En aras de la rapidez pretendíamos saltarnos la fase de equilibrio osmótico celular posdescongelación. Otros lo hacían y a nosotros tampoco nos iba nada mal con el recuento celular total.
Ahora bien, la observación inducía a pensar que la membrana citoplasmática seguía soportando la integridad celular, las CNT estaban ahí, pero quedaba dañada enseguida lo suficiente como para permitir la entrada del colorante.
Entonces tuvimos la buena suerte de dar con el bioquímico y biólogo molecular Dr. Luciano Rodríguez Gómez, del Banc de Sang i Teixits de Barcelona, y su tesis doctoral 17 a la que con el trascurso del tiempo ha ido haciendo evolucionar, quien terminó sumándose a este proyecto. La mala suerte fue no haber contactado con él al menos dos meses antes. La solución al problema va a venir dada por las siguientes modificaciones respecto a la técnica descrita solo aplicables a las CPH descongeladas no sometidas a una etapa de estabilidad osmótica previa:
1. Descongele el tubo según se ha descrito.
2. Mezcle volumen a volumen las células con PBS-A al 10% (PBS al que se añade albúmina humana al 20%, Grifols®, España, para que quede a una concentración final del 10%).
3. Incube 5 minutos a 4ºC.
4. Efectúe la subsiguiente dilución con PBS para conseguir la concentración celular deseada.
5. Continúe con el resto del procedimiento según se ha indicado.
De todos modos el proyecto es muy joven e irán surgiendo aportaciones. Por ej. ¿convendrá terminar trabajando a temperatura ambiente en lugar de a 4ºC? Porque en frío enlentecemos el metabolismo celular y disminuimos la toxicidad del DMSO pero por contra a esa temperatura la membrana pierde propiedades y dificultamos su normal funcionamiento. O ¿es procedente preparar, alicuotar y almacenar el PBS como hemos dicho o mejor simplificar y hacer todo el trabajo con PBS-A al 10%?
También, antes de hablar con el Dr. Rodríguez, estuvimos valorando otras opciones y seguimos atentos a recibir cualquier sugerencia. Algunas de ellas: trabajar con Plasmalyte® (Baxter); mezclar directamente la suspensión celular con el azul de tripán, dado que es un coloide, en dilución 1/2 o lo mismo pero al 1/10; mezclar primero con tripán y pasados unos minutos hacer la dilución con PBS; utilizar plasma autólogo como diluyente, con el posible problema de que las proteínas interfieran en la lectura; dextrano u otros coloides; medio de cultivo 8; etc.
Ahora bien, es esencial que el método sea rápido para que resulte útil, sin pasar por sucesivas resuspensiones, lavados o centrifugaciones. Habrá que probar y ver para ir mejorándolo.
De cualquier manera los resultados que hemos presentado se encuentran en línea con los recogidos en la literatura pero estamos convencidos de que los podemos mejorar con mínimas variaciones en la metodología utilizada, como la propuesta, tanto en lo referente a disminuir su alta sensibilidad al tiempo trascurrido desde la descongelación, como a subir los porcentajes obtenidos y la reproducibilidad. En esta tarea estamos los grupos colaboradores con el proyecto.
Pero estos resultados son orientativos, se basan en una serie muy corta que no soporta un análisis estadístico. Hemos leído un total de 25 aféresis desglosadas como sigue: 6 en fresco, 14 en tubo piloto y 5 en infusiones todas ellas descongeladas y lavadas. Lo que ha ido entrando y ha dado tiempo a leer en este corto periodo de tiempo mientras montábamos la técnica, más algunos tubos que teníamos congelados.

FASES DEL PROCESAMIENTO DE CPH-A EN LAS QUE NOS PLANTEAMOS CUANTIFICAR LA VIABILIDAD

Es la última gran pregunta que nos hacíamos en relación a este asunto.
- Para precongelación y lavado preinfusión, vea el apartado anterior.
- En cuanto a descongelación sin manipulación adicional podría trabajarse con:
- Primer tubo piloto: después de un mínimo de 24 horas tras la congelación. En realidad procesaríamos conjuntamente todos los que haya que descongelar de la semana anterior. Esta información nos indica que el producto está en buenas condiciones tras los agresivos procesos de congelación y descongelación; ha existido una manipulación importante luego hay que confirmar que no se ha visto afectado 1. Da luz verde para continuar con el plan previsto para el enfermo. En caso contrario habría que replantearse el caso, posiblemente volver a movilizar y recolectar.
Tras esta determinación, a la que añadiríamos otras pruebas que se realizan habitualmente, remitiríamos un segundo informe complementario del inicial que únicamente indicaba lo recolectado y su viabilidad.
- Segundo tubo piloto: descongelaríamos un segundo tubo si trascurre un largo periodo entre la aféresis y la solicitud de la infusión, i.e., en los segundos trasplantes.
Periódicamente se cuestiona si los injertos se van deteriorando conforme trascurre el tiempo de almacenamiento 6,8,9. Las temperaturas tan bajas de conservación, de -150 a -196ºC en general, y siguiendo las leyes de la termodinámica, no parece que vayan a permitir excesivo movimiento de las moléculas. Pero sí es cierto que a mayor tiempo trascurrido, mayor riesgo. Porque aunque cada depósito de almacenamiento cuenta con sus propias alarmas, el conjunto está conectado a una central con presencia de personal 24 horas y se hacen controles manuales, nadie puede garantizar que no se produzca un descuido. Luego es razonable, antes de tomar decisiones terapéuticas irreversibles, disponer de esa información adicional. De saltarnos este paso no se dispondría de esos datos hasta el momento de la infusión lo cual ya solo sería útil para los enfermos que vengan a continuación.
- Y por último en el producto descongelado para infusión directa sin lavado, para saber lo que estamos infundiendo o, si procede, como validación del método.
Aunque decíamos que hay una variabilidad sustancial en la forma de trabajar entre las diferentes escuelas cada una con sus motivos y condicionantes.
No obstante, sí que habría que tomar mayores precauciones en determinadas circunstancias como hallarnos ante malos movilizadores o en aquellos pacientes en los que no se haya recolectado una cifra de células CD34+ de al menos 2x106/kg de peso 8.
Para rizar el rizo ahora podríamos plantearnos, dentro de la norma, lo que ya sobrepasa los objetivos de este trabajo. Por ej. cuándo cuantificamos las CNT, las CD34+ con su viabilidad o los cultivos clonogénicos si podemos decidir al respecto. Desde luego si se dispone de una muestra a la que se va a realizar otra prueba poco cuesta, y en ciertas fases es imprescindible, hacerle también un recuento de CNT con contador automático. Y la microbiología no puede dejar de hacerse al recibir el producto, tras la manipulación justo antes de la congelación y al final de todo el proceso de descongelación o lavado.
Para más inri y no menos importante también habría que tener en consideración otros factores como la reproducibilidad de algo en principio tan sencillo como la cuantificación de CNT mediante analizadores hematológicos diferentes. Porque muchos laboratorios basan al menos parte de sus controles de calidad en estas cifras. Y no estamos hablando de muestras de sangre periférica normales sino de la celularidad de una aféresis con sus particularidades. El tema se complica todavía más con el recuento diferencial leucocitario automático si queremos saber el tipo de células que tenemos o informar el contenido de las mononucleares. Pero ya nos hemos extendido demasiado. Este y otros cuantos temas dan cada uno por sí solo para un artículo.
En cuanto al nuestro, lo comentamos al poco de entrar en vigor los estándares FACT-JACIE de 2018, nos pusimos manos a la obra en el intercambio de experiencias con otros grupos y decidimos iniciar la revisión bibliográfica. Se optó por que fuese Alicante quien pusiese la técnica en marcha. Como hemos comentado la casuística es insuficiente aunque muy aclaratoria. A partir de ahora habrá que terminar de extraer y estandarizar la información restante.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. FACT-JACIE international standards for hematopoietic cellular therapy. Product collection, processing, and administration. 7th ed, 2018.
    https://www.ebmt.org/jacie-standards/7th-edition-effective-june-1st-2018.
  2. Beksac M, Preffer F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone Marrow Transplant. 2012 Nov;47(11):1391-6. Epub 2011 Dec 5. PMID: 22139068. DOI: 10.1038/bmt.2011.240
  3. Strober W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 2001 May; Appendix 3:Appendix 3B. DOI: 10.1002/0471142735.ima03bs21. PMID: 18432654.
  4. Strober W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 2015 Nov 2;111:A3.B.1-3. DOI: 10.1002/0471142735.ima03bs111. PMID: 26529666.
  5. Kim JS, Nam MH, An SS, Lim CS, Hur DS, Chung C, Chang JK. Comparison of the automated fluorescence microscopic viability test with the conventional and flow cytometry methods. J Clin Lab Anal. 2011;25(2):90-4. DOI: 10.1002/jcla.20438. PMID: 21437999.
  6. Winter JM, Jacobson P, Bullough B, Christensen AP, Boyer M, Reems JA. Long-term effects of cryopreservation on clinically prepared hematopoietic progenitor cell products. Cytotherapy. 2014 Jul;16(7):965-75. PMID: 24910385. DOI: 10.1016/j.jcyt.2014.02.005
  7. Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D. ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82(1):9-17. Epub 2011 Sep 13. DOI: 10.1002/cyto.b.20612. PMID: 21915992.
  8. Vosganian GS, Waalen J, Kim K, Jhatakia S, Schram E, Lee T, Riddell D, Mason JR. Effects of long-term cryopreservation on peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 2012 Nov;14(10):1228-34. Epub 2012 Aug 17. DOI: 10.3109/14653249.2012.706707. PMID: 22900962.
  9. Kubiak A, Matuszak P, Bembnista E, Kozlowska-Skrzypczak M. Banking of Hematopoietic Stem Cells: Influence of Storage Time on Their Quality Parameters. Transplant Proc. 2016 Jun;48(5):1806-9. PMID: 27496496. DOI: 10.1016/j.transproceed.2016.03.011.
  10. Lecchi L, Giovanelli S, Gagliardi B, Pezzali I, Ratti I, Marconi M. An update on methods for cryopreservation and thawing of hemopoietic stem cells. Transfus Apher Sci. 2016 Jun;54(3):324-36. DOI: 10.1016/j.transci.2016.05.009. Epub 2016 May 11. PMID: 27211042.
  11. Louis KS, Siegel AC. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 2011;740:7-12. DOI: 10.1007/978-1-61779-108-6_2. PMID: 21468962.
  12. Otrock ZK, Sempek DS, Carey S, Grossman BJ. Adverse events of cryopreserved hematopoietic stem cell infusions in adults: a single-center observational study. Transfusion 2017 Jun;57(6):1522-1526. DOI: 10.1111/trf.14072. Epub 2017 Mar 16. PMID: 28301051.
  13. Shu Z, Heimfeld S, Gao D. Hematopoietic stem cell transplantation with cryopreserved grafts: adverse reactions after transplantation and cryoprotectant removal prior to infusion. Bone Marrow Transplant. 2014;49(4):469-76. DOI: 10.1038/bmt.2013.152. PMID: 24076548. PMCID: PMC4420483.
  14. Foïs E, Desmartin M, Benhamida S, Xavier F, Vanneaux V, Rea D, Fermand JP, Arnulf B, Mounier N, Ertault M, Lotz JP, Galicier L, Raffoux E, Benbunan M, Marolleau JP, Larghero J. Recovery, viability and clinical toxicity of thawed and washed haematopoietic progenitor cells: analysis of 952 autologous peripheral blood stem cell transplantations. Bone Marrow Transplant. 2007 Nov;40(9):831-5. Epub 2007 Aug 27. PMID: 17724443. DOI: 10.1038/sj.bmt.1705830.
  15. Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfield RE, Adamson JW, Migliaccio G, Migliaccio AR, Taylor PE, Stevens CE. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(22):10119-22. PMID: 7479737. PMCID: PMC40747.
  16. Zinno F, Landi F, Aureli V, Caniglia M, Pinto RM, Rana I, Balduino G, Miele MJ, Picardi A, Arcese W, Isacchi G. Pre-transplant manipulation processing of umbilical cord blood units: Efficacy of Rubinstein's thawing technique used in 40 transplantation procedures. Transfus Apher Sci. 2010 Oct;43(2):173-8. Epub 2010 Aug 3. PMID: 20685166. DOI: 10.1016/j.transci.2010.07.005.
  17. Rodríguez Gómez L. Reconstitución de productos hematopoyéticos criopreservados: control calidad, estabilidad osmótica y lavado de DMSO. Tesis doctoral. Universidad Autónoma de Barcelona, 2005. https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/4471/lrg1de1.pdf?sequence=1&isAllowed=y







 

 

 

1000 Characters left