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Vox Sanguinis International Forum on aplication of fetal blood grouping: summary  

Comentado por: Dra. Erkuden Aramburu.

Autores. A. G. Daniels, K. Finning, M. Lozano, C. A. Hyland, Y.-W. Liew, T. Powley, L. Castilho, C. Bonet Bub, J. M. Kutner, F. Banch Clausen, M. Christiansen, K. Sulin, K. Haimila, T. J. Legler, M. Lambert, H. Ryan, S. N Loingsigh, A. Matteocci, L. Pierelli, B. T. Dovc Drnovsek, I. Bricl, N. Nogues, E. Muniz-Diaz, M. L. Olsson, A. Wikman, M. de Haas, C. E. van der Schoot, E.Massey & C. M. Westhof

La clonación de los genes de grupo  sanguíneo y la posterior compresión del contexto molecular de los polimorfismos de grupo sanguíneo han hecho posible la predicción de los fenotipos a partir del estudio del ADN cuando no se dispone de una muestra de hematíes. Una importante aplicación de esta tecnología es la determinación del grupo sanguíneo del feto sin necesidad de utilizar métodos invasivos, caros y peligrosos para el feto.

La mejor fuente de ADN fetal es el ADN fetal libre derivado de los trofoblastos de la placenta y presente en el plasma de las mujeres embarazadas. Lo que tienen de  ventaja es que se puede obtener a partir de una muestra de sangre de la madre y como desventaja que el ADN fetal no puede separase del ADN materno.

Entre las semana 10 y 20 de embarazo, al 10-15 % del ADN libre aislado en la sangre de la madre es de origen fetal, con un rango entre el  3y el 30%. Después de la semana 21 la fracción de ADN fetal se incrementa a un ritmo de 1% a la semana

La mayor causa de EHRN es la presencia de  anticuerpo Anti-D (RH1) del sistema Rh.  Los polimorfismos Rh están, en su mayoría, controlados por los genes Rh: RHD y RHCE.

Alrededor del 15 % de la población caucásica son D- negativos y, en la mayoría de los casos, este fenotipo es resultado de homocigosidad para la deleción del gen completo RHD. En la población Africana el D- negativa ronda el 5%. En Asia el D- negativo es raro.

La determinación del tipo D fetal en una mujer embarazada con anti-D demuestra si el feto corre riesgo de EHRN. Si el feto es D- negativo no existe riesgo y no se requieren más estudios; Si es D-positivo el embarazo debe de ser monitorizado y considerado un feto a riesgo.

El tipaje D-fetal en una mujer embarazada con un nivel de anti-D significativo se realiza de rutina en algunos países siendo considerada una prueba estándar. No es una medida universalmente adoptada. Las mujeres embarazadas  con anti-D normalmente carecen de RHD por lo que cualquier secuencia RHD detectada será de origen fetal y se asume que el feto es D- positivo, mientra que si no se detecta RHD el feto se asume que es D- negativo.

La detección de regiones de RHD seleccionadas previene el hallazgo de  resultados falsos  en fetos D- negativos con genes poco comunes que están inactivos.  El uso de PCR cuantitativa detecta la presencia de genes RHD inactivos en madres D-negativas lo que evita resultados falsos positivos.

Una complicación acerca de este método relativamente simple es la ausencia de un control positivo para un resultado negativo. El fallo en la detección del gen RHD en un feto positivo puede ser consecuencia de que haya muy poco ADN fetal o que se haya producido un fallo en la técnica.

La incorporación de reacciones frente a un gen “housekeeping”, tales como CCR5 o GAPDH, demuestra que la amplificación ha tenido lugar, pero se amplifican lo fragmentos tanto del ADN fetal como del materno lo que no provee de ningún control específico para detectar la presencia adecuada de ADN fetal

Se han empleado al menos tres métodos para detectar ADN fetal en fetos D negativos, ninguno de ellos es totalmente fiable, pero si que encarecen las pruebas :

  1. Incluye un test para un gen ligado al cromosoma Y, como el SRY, aunque esta dará solo resultado positivo en el caso de que el feto sea varón lo que introduce un dilema ético si la determinación del sexo no es requerida.
  2. Este método trata de un test que incluye una variedad de polimorfismos con la intención de detectar una secuencia que esté presente  n el ADN del feto pero no en el de la madre.
  3. El tercer método utiliza la epigenética. RASSF1A es un gen tumor –suppressor en el que el promotor esta hipermetilado en el ADN fetal e hipometilado en el ADN materno. El tratamiento del ADN  con un enzima de restricción sensible a la metilación resulta en la digestión de la secuencia del ADN materno pero deja intacto el ADN fetal

Otros anticuerpos que causan EHRN son anti- C (RH2), E (RH3), y c (RH4) codificados por RHCE  y K (KEL1) codificado por KEL.

Se puede hacer el tipaje en el feto de estos grupos sanguíneos a las mujeres que presentan aloinmunización. También puede estudiarse el genotipo HPA ya que algunos anticuerpos plaquetario ocasionan trombopenia neonatal aloinmune.

En los años 70 la introducción de la profilaxis anti-D disminuyó de forma significativa la incidencia de EHRN. Se administraba una dosis de inmunoglobulina a las mujeres D –negativas inmediatamente después del parto de un recién nacido D positivo.

Al principio de los años 2000 la profilaxis anti-D rutinaria se administraba a las mujeres embarazadas D – negativas entre la semana 28-34 de gestación para disminuir la inmunización antenatal.

En la población caucásica aproximadamente un 38% de las mujeres D negativas tiene un feto negativo por lo que recibirían una inmunoglobulina anti-D  innecesaria, por lo tanto es más beneficioso proceder a la detección de D fetal en sangre materna. El coste es el mismo o más barato.

Pocos países europeos tienen introducido esta técnica y algunos la están  poniendo en marcha actualmente.

El propósito de este Forum Internacional  es determinar dónde se está estudiando el grupo fetal- tanto para predecir el riesgo de EHRN en niños de madres aloinmunizadas como para determinar a necesidad de realizar profilaxis ante natal en todas las mujeres D- negativas embarazadas, en que momento del embarazo se realiza el test, los métodos utilizados y qué grupos se estudian.

Se obtuvieron respuestas de 10 países: Dinamarca, Inglaterra, Finlandia, Alemania, Irlanda, Italia, Países Bajos, Eslovenia, España y Suecia.

RESUMEN DE LAS RESPUESTAS (ver Tabla 1)

Pregunta 1

¿Realizan en su país el estudio del genotipo RHD en el ADN fetal en sangre materna? Si es así ¿Es una práctica rutinaria  para todas las mujeres embarazadas o es a demanda del ginecólogo?

Excepto Irlanda, todos los países respondieron que realizan la prueba de genotipo RHD fetal hasta cierto punto, aunque en USA solo la ofrece un laboratorio comercial.

En Brasil lo realizan unos pocos laboratorios. En la mayoría de los casos se realiza a petición del ginecólogo aunque en algunos países europeos lo hacen de rutina.

Pregunta 2

Si  se realiza el test ¿es para tratar a mujeres embarazadas con anti- RhD o a todas las mujeres RhD – negativas embarazadas, a fin de evitar profilaxis anti-RHD innecesarias?

En Inglaterra y Suecia se ofrece el estudio en algunas regiones.

En Inglaterra el NICE ( National Institute for Heatlth and Care Excellence) –Inglaterra y Gales, publicó en 2016 una guía recomendando estudio prenatal no invasivo del genotipo RHD  como una opción coste/ efectiva de cara a la profilaxis ante natal con inmunoglobulina anti- D.

En Alemania se han publicado nuevas  pautas que para evitar profilaxis antenatal innecesaria y se permite hacer el estudio a aquellas mujeres que no están de acuerdo con la Profilaxis Rh-D antenatal generalizada.

Pregunta 3

¿A partir de que semana se realiza el test? ¿Se realizan más estudios cuando el feto es aparentemente negativo para confirmar la presencia de ADN fetal?

La primera semana en la que se lleva  acabo el estudio varía ampliamente. De la semana 9 a la semana 18 semana en mujeres embarazadas con anti-D y de la semana 1 a la semana 27 para evitar profilaxis innecesaria.

En Inglaterra y Dinamarca no se realizan estudios adicionales cuando el feto resulta RHD negativo. En Finlandia, Alemania y los Pises Bajos no se llevan acabo estudios adicionales. Para estudiar mujeres embarazadas aloinmunizadas cuando el resultado predice un feto RHD negativo, se requiere una segunda muestra en Finlandia y Alemania y se incluye un test Y-linked como control en los Países Bajos, si el test da resultados negativos se estudian una serie de polimorfismos adicionales. Australia incluye un control Y-linked y test epigenético RASSFIA, además de analizar una segunda muestra cuando el resultado ha sido RHD negativo. No se obtuvo información de la tecnología utilizada en USA.

Pregunta 4

¿Qué tecnología se aplica?

 Todos los países  utilizan alguna forma de PCR cuantitativa (excepto USA donde aplican un proceso que implica espectrometría de masa).Alemania también utiliza secuenciación.

Todos los países que informan detalles de la prueba RHD incluyen test para el exón 5 (presumiblemente para detectar el RHDΨ), más exón 7 o 10 o ambos

Pregunta 5

¿Realizan estudio de otros grupos sanguíneos y antigenos plaquetares en el feto?

Dinamarca, Inglaterra, Alemania y los Países Bajos ofrecen estudios para RH C, c, E y K en mujeres inmunizadas. En Eslovenia: C, c, y E. En España y Suecia a c.  Alemania, España, Países Bajos y Suecia ofrecen estudio HPA- 1 a, Alemania también incluye HPA- 5b y HPA-15a. Australia, Brasil, Dinamarca y España que están desarrollando test para grupos de plaquetas y hematíes adicionales.

Pregunta 6

Si no se realiza genotipo de grupo sanguíneo fetal en su país ¿existe algún plan para introducir este servicio en el futuro, tanto para mujeres aloinmunizadas como para mujeres RHD negativas embarazadas? Si no, describa, por favor, por qué no.

En Irlanda se esta desarrollando actualmente un test de screening RHD fetal desde la semana 11 de gestación, se espera que está listo para finales de 2017.

Una razón por la que USA no se plantea extender este servicio es por que los seguros no lo consideran necesario médicamente.

 

Table 1. Summary of submitted responses to the questionnaire

Country

RHD fetal genotyping available?

Screening of D– pregnant women?

Minimum time of testing in weeks of gestation

RHD exons tested by RQPCRa

Extra tests applied in RHD testing

Other groups tested

Immunised

Screening

Immunised

Screening

Denmark

Yes

All

14

14

5,7,10

None

None

C,c,E,K

England

Yes

Someb

16

11

4,5,7,10 or 5,7

None

None

C,c,E,K

Finland

Yes

All

16

24

5,7

Y + 2nd samplec

Y

None

Germany

Yes

Some

9

20

 

2nd samplec

None

C,c,E,K HPAd

Ireland

No

No

11e

11e

7,10e

Nonee

Nonee

None

Italy

Yes

No

18

   

2nd samplec

 

None

Netherlands

Yes

All

11

27

 

Y + other polymorphisms

None

C,c,E,K HPA‐1a

Slovenia

Yes

Somef

16

   

Y

 

C,c,E

Spain

Yes

Somef

9

 

5,10 or 5,7

Y + 2nd samplec

 

c, HPA‐1a

Sweden

Yes

Someb

10

   

2nd samplec

None

c

Australia

Yes

No

12

   

Y + RASSF1A + 2nd samplec

 

None

Brazil

Yes

Somef

16

   

Y

 

None

USA

Yesg

No

         

None

  • a Real‐time quantitative polymerase chain reaction.
  • b In some regions.
  • c Second sample requested when fetus predicted to be D‐negative.
  • d Tests for HPA‐1a, HPA‐5b, and HPA‐15a.
  • e In development.
  • f Limited service only
  • g Provided by one commercial laboratory.

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